促甲狀腺激素受體(TSH Receptor,TSHR)在體內(nèi)外場(chǎng)景中均具有廣泛的應(yīng)用。人抗TSHR單克隆抗體可用于TSHR自身抗體(TRAb)的檢測(cè)，有助于自身免疫性甲狀腺疾病的診斷和治療。這些TSHR單抗中，以M22™代替現(xiàn)有檢測(cè)法中的TSH是目前靈敏度和特異性*高的檢測(cè)方法。目前實(shí)現(xiàn)商品化的M22™已作為世界衛(wèi)生組織促甲狀腺抗體的國(guó)際參考物質(zhì)，用于TRAb檢測(cè)方法的校準(zhǔn)。
背景
早在1956年，Adams和Purves就shou次報(bào)道了甲狀腺疾病患者血清中，存在與TSH不同的長(zhǎng)效甲狀腺刺激因子(LATS) [1]。當(dāng)時(shí)研究發(fā)現(xiàn)LATS刺激甲狀腺的機(jī)制與血清蛋白的IgG部分相關(guān)。1974年，RSR創(chuàng)始人Smith博士與Hall的聯(lián)合研究證實(shí)了Graves病患者血清中這種因子實(shí)質(zhì)上是特異性靶向TSHR的自身抗體（即TRAb），而TRAb對(duì)TSHR的刺激是造成Graves病患者甲狀腺功能亢進(jìn)的病因[2]。這一研究結(jié)果促進(jìn)了第一代TRAb體外檢測(cè)方法的發(fā)展，為自身免疫性甲狀腺疾病(AITD)的輔助診斷和管理提供依據(jù)。
TSHR研究的下一個(gè)重要里程碑是1989 - 1990年，在四個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)室中克隆了TSHR基因[3-7]。這為T(mén)SHR單克隆抗體的體外制備提供更多基礎(chǔ)。
2003年，Smith博士從一名Graves病患者的外周血淋巴細(xì)胞中，分離出促甲狀腺激素受體單克隆自身抗體(稱(chēng)為M22™)[8]。隨后發(fā)現(xiàn)的多種TSHR單克隆自身抗體中，按生理功能又可為兩種阻斷型單抗(5C9和K1-70)和一種刺激型單抗(K1-18)[9]。重組TSHR基因表達(dá)技術(shù)的發(fā)展，配合目前已發(fā)現(xiàn)的TSHR單抗，使TSHR富亮氨酸重復(fù)結(jié)構(gòu)域(LRD)可與M22和K1-70的Fab片段結(jié)合為抗原抗體復(fù)合物，以結(jié)晶形式得以提取[10,11]。這為后續(xù)研究中TSHR LRD與兩種不同效應(yīng)的單克隆抗體間分子的相互作用提供助益[10,11]。
當(dāng)前多項(xiàng)研究成果證實(shí)，體外環(huán)境中的小鼠胚胎干細(xì)胞可以通過(guò)TSH刺激，定向轉(zhuǎn)化為功能正常的甲狀腺濾泡細(xì)胞。這為長(zhǎng)期接受激素替代治療的甲狀腺疾病患者，開(kāi)辟了功能恢復(fù)性治療的新前景[12,13]。我們?cè)诮诘难芯恐羞€建立了Graves眼病(GO)的小鼠模型[14]，并制備了具有熱穩(wěn)定性的TSHR LRD制劑，shou次解析了無(wú)配體的糖蛋白激素受體結(jié)構(gòu)域的晶體結(jié)構(gòu)（2.83 Å分辨率）[15]。這些重大的科學(xué)結(jié)果不斷促進(jìn)對(duì)AITD患者診斷、監(jiān)測(cè)以及管理的改進(jìn)。
TRAb的體外應(yīng)用實(shí)例
如上所述，在Graves病發(fā)病機(jī)制中，患者血清中的自身抗體對(duì)TSHR的刺激起核心作用。因TRAb檢測(cè)的重要性，TRAb的檢測(cè)方法也歷經(jīng)了多代的發(fā)展：
一代檢測(cè)：
液相檢測(cè)法，利用血清TRAb可以抑制放射性I-125標(biāo)記的TSH與TSHR相結(jié)合的特性，使用聚乙二醇將抗原抗體復(fù)合物沉淀[16]。該檢測(cè)法是Graves病診斷的一個(gè)里程碑。在早期開(kāi)展的生物檢測(cè)法中，通常以刺激型抗體TSAB或TSH對(duì)表達(dá)TSHR的活細(xì)胞進(jìn)行刺激，以其產(chǎn)生的第二信使cAMP作為檢測(cè)標(biāo)志物來(lái)間接檢測(cè)TRAb。該試驗(yàn)法耗時(shí)較久且流程復(fù)雜，不適宜大規(guī)模檢測(cè)。一代液相法作為替代方案改變了這一局面。
二代檢測(cè)：
第二代檢測(cè)改為固相檢測(cè)法，樣品中的TRAb與固定在ELISA微孔或塑料管上的TSHR相結(jié)合，隨后與生物素或I-125標(biāo)記的TSH反應(yīng)實(shí)現(xiàn)檢測(cè)[17]。固相檢測(cè)法實(shí)現(xiàn)了非放射性同位素標(biāo)記和檢測(cè)自動(dòng)化，與第一代檢測(cè)法相比，提高了方法學(xué)的靈敏度和特異性。
三代檢測(cè)：
在新的第三代檢測(cè)中，以M22-生物素替代二代檢測(cè)中的TSH-生物素，從而進(jìn)一步提高了靈敏度和特異性[18]。與二代檢測(cè)中TSH與TSHR間的結(jié)合相比，M22因其復(fù)合物不易解離，在TRAb的競(jìng)爭(zhēng)抑制法檢測(cè)中更具有優(yōu)勢(shì)。這一特性使配體在嚴(yán)格的洗滌步驟里保持緊密結(jié)合，使其更適合用于自動(dòng)化檢測(cè)系統(tǒng)。第三代TRAb檢測(cè)目前在各地的各個(gè)平臺(tái)上廣泛應(yīng)用。即使檢測(cè)時(shí)長(zhǎng)控制在半小時(shí)內(nèi)，也能保持良好的靈敏度和特異性[18,19]。
TRAb的濃度通常以IU/L表示，單位定義參考了國(guó)家生物標(biāo)準(zhǔn)和控制研究所(NIBSC)提供的世界衛(wèi)生組織(WHO)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。該類(lèi)物質(zhì)通常用于TRAb檢測(cè)方法的校準(zhǔn)。第一代標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(編號(hào)90/672)源自一位患者的捐贈(zèng)。隨著第一代標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的耗竭，M22™的開(kāi)發(fā)誕生了第二代國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(編號(hào)08/204)。在NIBSC 08/204標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中，每支安瓿的正常人血清中含有1 μg凍干M22 IgG。當(dāng)前M22™已規(guī)模化投產(chǎn)，實(shí)現(xiàn)了從實(shí)驗(yàn)室研究向產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)的轉(zhuǎn)變。（RSRTJ解讀：保證了M22的產(chǎn)出及供應(yīng)問(wèn)題。）
TSHR的體外應(yīng)用實(shí)例
用TSHR260-JMG55替換對(duì)應(yīng)片段后的全長(zhǎng)TSHR，無(wú)論是對(duì)TSH或M22的刺激信號(hào)反饋，還是結(jié)合Graves病患者的TSHR自身抗體時(shí)，耐熱型TSHR均與野生型TSHR的性能表現(xiàn)接近[15]。這些試驗(yàn)均證實(shí)，耐熱突變不影響TSHR本身的抗原性。
TSHR的體內(nèi)應(yīng)用研究
在目前的設(shè)想中，穩(wěn)定的TSHR制劑可以對(duì)患者體內(nèi)的血清TRAb特異性免疫吸附。在需要從患者外周循環(huán)中緊急清除TRAb的危急臨床危重情況下，通過(guò)TRAb與TSHR260-JMG55結(jié)合的機(jī)制，將TRAb從患者血漿中分離，從而提供快速有效的治療效果。
腫瘤治療展望
在甲狀腺癌的控制策略上也可提供新思路：通過(guò)一種含TSH片段的納米脂質(zhì)體，裝載化療藥物后靶向到達(dá)病灶處的TSHR[24]。另一種方法基于TSHR結(jié)合碳納米管，這種納米管能將外部光能轉(zhuǎn)化為熱能，從而在局部殺死癌細(xì)胞[25]。此外，針對(duì)TSHR的小分子拮抗劑，通過(guò)抑制信號(hào)通路的方法來(lái)抑制甲狀腺癌進(jìn)展[26]。目前在Graves病患者的臨床試驗(yàn)中，采用K1-70單次遞增劑量給藥，已開(kāi)展涉及安全性、耐受性、藥代動(dòng)力學(xué)和藥效學(xué)的I期臨床研究（結(jié)果已于22年發(fā)表）。
K1-70藥用化實(shí)例
一名患有Graves病、嚴(yán)重GO和局部晚期伴遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移的高分化甲狀腺濾泡癌的女性患者，曾接受了K1-70作為藥物的藥效觀(guān)察[27,28]。給藥前該患者GO臨床活動(dòng)評(píng)分(CAS)為6/7，復(fù)視，雙眼突出量21 mm，伴水腫、眼瞼腫脹、眼球運(yùn)動(dòng)時(shí)疼痛、眼瞼紅斑。她開(kāi)始接受為期3周，個(gè)體化定制劑量的K1-70用藥，旨在中和她體內(nèi)高水平的促甲狀腺刺激型自身抗體。第一次給藥時(shí)TRAb為130 IU/L，甲狀腺刺激活性>2000%。該患者同時(shí)服用樂(lè)伐替尼治療甲狀腺癌?；颊叻答伔Q(chēng)在開(kāi)始K1-70治療后不久，她的眼部癥狀有所改善；CAS提高到0-1/7，雙側(cè)突出量改善為19 mm，可通過(guò)手術(shù)矯正復(fù)視。接受K1-70治療期間，患者恢復(fù)了駕駛能力，GO一并轉(zhuǎn)入穩(wěn)定期。在樂(lè)伐替尼因副作用而停藥期間，僅K1-70單獨(dú)用藥，也觀(guān)察到腫瘤進(jìn)展放緩。在持續(xù)K1-70治療2年且劑量提高至120 mg/次時(shí)，該患者身上仍未觀(guān)察到不良反應(yīng)。
這些早期研究表明，用K1-70阻斷TSHR活性的體內(nèi)治療方式，在控制Graves病、GO和甲狀腺癌中甲狀腺功能亢進(jìn)上具有廣闊的應(yīng)用前景。
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參考文獻(xiàn)：Furmaniak, J., et al. "Practical applications of studies on the TSH receptor and TSH receptor autoantibodies." Endocrine 68.2 (2020): 261-264.
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