標(biāo)題： 在自動(dòng)化系統(tǒng)上(SkyLAB 752) 用ELISA 方法檢測(cè)乙酰膽堿受體抗體：根據(jù)臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(huì) (CLSI) EP15-A 評(píng)估其分析性能
作者：Letizia Abbracciavento1, Ruggiero Fumarulo1, Marilina Tampoia1
摘要：
背景： 乙酰膽堿受體抗體 (AChRAb) 目前在臨床實(shí)驗(yàn)室中主要通過(guò)放射免疫測(cè)定法來(lái)檢測(cè)，該法利用從人體肌肉中提取的受體并通過(guò)125I-α-金環(huán)蛇毒素標(biāo)記進(jìn)行檢測(cè)和定量。Hewer 等人（2006）基于純化的胎兒和成人乙酰膽堿受體的用途，開(kāi)發(fā)了一種新的酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法 (ELISA)。根據(jù)臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(huì) (CLSI) 的建議，本研究的目的為驗(yàn)證 ELISA 測(cè)試并制定其在自動(dòng)儀器上的實(shí)施方案。
方法： 為了得到批內(nèi)，不同檢測(cè)日間和實(shí)驗(yàn)室內(nèi)的精密度，我們使用RSR Ltd廠家診斷試劑盒中的兩種 AChRAb 對(duì)照品，一種高值陽(yáng)性對(duì)照品 (C1) 和一種低值陽(yáng)性對(duì)照品 (C2)，在不同日內(nèi)進(jìn)行了5次獨(dú)立的試驗(yàn)，每次均進(jìn)行3次重復(fù)檢測(cè)。診斷試劑盒中包含四種不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品（E1，0.5 nmol/L；E2，1.0 nmol/L；E3，6.5 nmol/L；E4，20 nmol/L），為驗(yàn)證正確度，進(jìn)行連續(xù)五天重復(fù)測(cè)試。
結(jié)果：在精密度測(cè)試過(guò)程中，高值對(duì)照品的檢測(cè)平均濃度為 11.2 nmol/L（對(duì)照 C1），其批內(nèi)CV值為7.9%（95% CI，0.61~1.52），不同檢測(cè)日間CV值為 8.4%（95% CI，0.00~2.98），實(shí)驗(yàn)室內(nèi)CV值為11.5%（95%CI，0.92~3.12）。低值對(duì)照品的檢測(cè)平均濃度為3.2 nmol/L（對(duì)照 C2），批內(nèi)CV值為5.6%（95% CI，0.13~0.32），不同檢測(cè)日間CV值為1.9%（95% CI，0.00~0.33）， 實(shí)驗(yàn)室內(nèi)CV值為6.0% （95% CI，0.15 ~ 0.39）。以標(biāo)準(zhǔn)偏差 (SD) 表示（實(shí)驗(yàn)室內(nèi)）的總重復(fù)性，C1 為 1.27，C2 為 0.19，更優(yōu)于廠家聲明的重復(fù)性獲得的驗(yàn)證值（分別為 1.37 和 0.49）[ SD (C1) = 0.95874 和 SD (C2) = 0.3589]。
CV值 | 11.2 nmol/L（商業(yè)對(duì)照C1） | 3.2 nmol/L（商業(yè)對(duì)照C2） |
批內(nèi) | 7.9%（95% CI，0.61~1.52） | 5.6%（95% CI，0.13~0.32） |
不同檢測(cè)日間 | 8.4%（95% CI，0.00~2.98） | 1.9%（95% CI，0.00~0.33） |
實(shí)驗(yàn)室內(nèi) | 11.5%（95%CI，0.92~3.12） | 6.0%（95% CI，0.15~0.39） |
計(jì)算SD | 1.27 | 0.19 |
廠商聲明SD | 1.37 | 0.49 |
結(jié)論： 在真實(shí)世界中獲得的分析性能證實(shí)了在實(shí)驗(yàn)階段產(chǎn)生的產(chǎn)品規(guī)范參數(shù)，并表明即使使用自動(dòng)化系統(tǒng)進(jìn)行分析，測(cè)試的可靠性仍然保證。測(cè)試的良好精密度和準(zhǔn)確度及其在易用性和快速響應(yīng)的自動(dòng)化系統(tǒng)上的可用性使我們得出結(jié)論，該測(cè)試對(duì)于常規(guī)使用是令人滿意的，并且可適用于 AChRAb 的長(zhǎng)期監(jiān)測(cè)。
關(guān)鍵詞：乙酰膽堿受體抗體，酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)，臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(huì)，驗(yàn)證
正文：
簡(jiǎn)介: 重癥肌無(wú)力(MG)是一種以神經(jīng)肌肉傳遞障礙為特征的自身免疫性疾病，乙酰膽堿受體自身抗體(AChRAb) 的檢測(cè)是診斷重癥肌無(wú)力 (MG) 一種非常有效且廣受認(rèn)可的方法。
AChRAb可以與成人和胎兒AChR的不同亞基發(fā)生反應(yīng)；然而，大多數(shù) (50%)是與α亞基胞外區(qū)特定的免疫顯性區(qū)域結(jié)合[1]。
目前，這些自身抗體的常規(guī)檢測(cè)主要基于用125I-α-BuTx 標(biāo)記的人類 AChR，125I-α-BuTx是一種與AChR親和度高的蛇毒素。
盡管放射免疫法檢測(cè)AChRAb被廣泛應(yīng)用，但使用放射性化合物有技術(shù)和環(huán)境上的限制。因此，使用不同技術(shù)和不同的抗原制備的檢測(cè)法作為放射免疫法的替代方法被提出。
2006年，Hewer 等在使用純化的胎兒和成人AChR的基礎(chǔ)上開(kāi)發(fā)了一種新的酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法 (ELISA) [2]。
這種 ELISA 方法顯示出良好的靈敏度(92%) 和出色的特異性(99%)。此外，比較ELISA法和RIA法，顯示兩種檢測(cè)法之間有很好的一致性（r = 0.85，n = 83，P<0.001）
為了確保滿足建立專業(yè)認(rèn)可的自身免疫實(shí)驗(yàn)室所需的要求，我們根據(jù)臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(huì) (CLSI) 的建議，驗(yàn)證了 ELISA 測(cè)試并制定了在自動(dòng)儀器上的實(shí)施方案 [3]。
此外，一旦實(shí)施并成為用戶的例行程序后，該方法可以通過(guò)經(jīng)認(rèn)可的外部質(zhì)量評(píng)估計(jì)劃(UK NEQAS)的參與進(jìn)行監(jiān)控。
材料與方法
AChRAb ELISA
Anti-AChRAb ELISA（RSR Ltd，Cardiff，UK）基于競(jìng)爭(zhēng)抑制法。
自動(dòng) ELISA 操作系統(tǒng)
根據(jù)廠家的建議，我們實(shí)驗(yàn)室使用Sky-LAB 752自動(dòng)ELISA操作系統(tǒng)（DASITGroup，Cornaredo，Italy）進(jìn)行AChRAb 測(cè)試。
方法驗(yàn)證
精密度和真值是驗(yàn)證測(cè)試所需的性能參數(shù)，根據(jù) CLSI 指南 EP15-A [3] 中的描述進(jìn)行評(píng)估。為了得到批內(nèi)，不同檢測(cè)日間和實(shí)驗(yàn)室內(nèi)的精密度，我們使用RSR Ltd廠商試劑盒中的兩種商業(yè) AChRAb 對(duì)照品，一種高值陽(yáng)性 (C1, 7.5 nmol/L) 和一種低值陽(yáng)性 (C2, 1.6 nmol/L)，在不同日內(nèi)進(jìn)行了5次獨(dú)立的試驗(yàn)，每次均進(jìn)行3次重復(fù)檢測(cè)。為研究正確度，對(duì)診斷試劑盒中包含的四種不同濃度水平的標(biāo)準(zhǔn)品（E1，0.5 nmol/L；E2，1.0 nmol/L；E3，6.5 nmol/L；E4，20 nmol/L）進(jìn)行連續(xù)五天復(fù)孔檢測(cè)。
外部質(zhì)量評(píng)估
一旦實(shí)施并且該方法成為用戶的常規(guī)方法，我們于2016年4月至2017年10月參與了英國(guó) NEQAS 質(zhì)量控制以評(píng)估AChRAb的檢測(cè)。
統(tǒng)計(jì)分析
ANOVA測(cè)試用于計(jì)算批內(nèi)變異系數(shù) (CV)% 和實(shí)驗(yàn)室內(nèi) CV%。 使用Analyze it軟件版本4.21進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。
結(jié)果
精密度分析
表 1 和表 2 顯示了 5 天內(nèi)獲得的測(cè)定值、平均值、標(biāo)準(zhǔn)偏差 (SD) 和方差。
精密度實(shí)驗(yàn)中兩個(gè)陽(yáng)性對(duì)照樣品（C1 和 C2）的結(jié)果見(jiàn)表 3。
總重復(fù)性以 SD（實(shí)驗(yàn)室內(nèi)）表示，結(jié)果 C1 為 1.27，C2 為 0.19，低于根據(jù)制造商聲明的重復(fù)性驗(yàn)證值（分別為 1.37 和 0.49），以SD表達(dá) [C1 的 SD = 0.95874 和 C2 的 SD = 0.3589]。
表1 AChRAb 高濃度陽(yáng)性對(duì)照品 (C1, 7.5 nmol/L)5天的檢測(cè)值、平均值、標(biāo)準(zhǔn)差（SD）和方差 
表2 AChRAb 低濃度陽(yáng)性對(duì)照品 (C2, 1.6 nmol/L)5天的檢測(cè)值、平均值、標(biāo)準(zhǔn)差（SD）和方差 
表3 根據(jù) CLSI EP 15-A 使用廠商提供的 2 個(gè)陽(yáng)性對(duì)照品（C1 和 C2）進(jìn)行的精密度實(shí)驗(yàn)
表4 根據(jù)標(biāo)準(zhǔn) CLSI EP15-A 使用廠商提供的4個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行正確度實(shí)驗(yàn) 
正確度研究
使用四種標(biāo)準(zhǔn)品檢測(cè)分析正確度顯示測(cè)定值的平均值與真實(shí)值之間具有良好的相關(guān)性。差異（系統(tǒng)誤差）是可以接受的，正如 P 值所證明的那樣，這些 P 值無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（表 4 和圖 1）。
圖 1 分析方法的不精確估計(jì)（系統(tǒng)誤差）
AChRAb 的室間質(zhì)量評(píng)價(jià)
對(duì) UK NEQAS 報(bào)告提供的數(shù)據(jù)分析表明，我們的結(jié)果在定性數(shù)據(jù)（陽(yáng)性/陰性）方面與所有其他 110 個(gè)參與實(shí)驗(yàn)室（Cohen's k = 1.000）一致。關(guān)于定量數(shù)據(jù)，我們的結(jié)果與使用我們 ELISA 方法的實(shí)驗(yàn)室的平均值沒(méi)有顯示出統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（Mann-Whitney 檢驗(yàn) p = 0.06）。然而，我們注意到 ELISA 結(jié)果在統(tǒng)計(jì)學(xué)上高于使用 RIA 方法獲得的結(jié)果（Mann-Whitney 檢驗(yàn) p = 0.0004）。
討論
AChRAb的測(cè)定是MG診斷和臨床隨訪的基本實(shí)驗(yàn)室支持[4, 5]。即使AChRAb 滴度不總是與疾病的嚴(yán)重程度相關(guān)，但單個(gè)患者的連續(xù)測(cè)定結(jié)果可能顯示出與MG癥狀的很好相關(guān)性 [6]。
盡管過(guò)去推薦的AChRAb 診斷方法是 RIA法，但ELISA方法已經(jīng)被認(rèn)為是一種合適的技術(shù) [7]。事實(shí)上，英國(guó) NEQAS 報(bào)告提供的數(shù)據(jù)顯示，大約一半的參與實(shí)驗(yàn)室使用市售的ELISA方法。將ELISA法測(cè)定結(jié)果與常規(guī) RIA 方法進(jìn)行比較，來(lái)評(píng)估其分析性能，發(fā)現(xiàn) RIA 和 ELISA 之間具有很好的一致性 [2]。
根據(jù)自身免疫實(shí)驗(yàn)室應(yīng)遵守的技術(shù)要求[8]，我們驗(yàn)證并證實(shí)了市售AChRAb ELISA在自動(dòng)化測(cè)試時(shí)的分析準(zhǔn)確性。
使用 SKYLab 752 儀器，我們發(fā)現(xiàn)以批內(nèi)精密度、不同檢測(cè)日間精密度和實(shí)驗(yàn)室內(nèi)精密度表示的分析誤差介于 1.9% 至 11.5% 之間，與其他自身抗體測(cè)定相比，該水平的誤差*可接受 [9]。在低水平和高水平AChRAb 陽(yáng)性對(duì)照品上測(cè)得的總體重復(fù)性，更優(yōu)于制造商聲明的性能指標(biāo)[3]。
因此，在真實(shí)世界中獲得的分析性能確認(rèn)了在實(shí)驗(yàn)階段中形成的產(chǎn)品規(guī)格參數(shù)，并表明即使在自動(dòng)化系統(tǒng)中進(jìn)行分析時(shí)，測(cè)試的可靠性仍然保證。
總體而言，該測(cè)試的良好精密度和準(zhǔn)確度及其在易用性和快速響應(yīng)性的自動(dòng)化系統(tǒng)上的可用性，使我們得出結(jié)論：該測(cè)試對(duì)于常規(guī)使用上是令人滿意的，并且可能適用于長(zhǎng)期監(jiān)測(cè)AChRAb。
為了確保自身免疫實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量體系的要求，我們參加了一次有組織的實(shí)驗(yàn)室間比較，我們的結(jié)果與參與室間質(zhì)量評(píng)價(jià)的其他實(shí)驗(yàn)室的結(jié)果非常吻合 [8]。
因此，我們獲得的定性結(jié)果與使用相同 ELISA 方法測(cè)定AChRAb 的其他實(shí)驗(yàn)室提供的平均數(shù)據(jù)一致。相反，使用RIA方法的實(shí)驗(yàn)室提供的定量數(shù)據(jù)低于ELISA方法提供的數(shù)據(jù)。
這種差異的可能解釋可以用標(biāo)準(zhǔn)品的ELISA 曲線動(dòng)態(tài)范圍來(lái)表示。抗體濃度測(cè)定中的這種差異阻礙了用兩種方法獲得的結(jié)果之間的定量比較。
在建立自身抗體檢測(cè)的參考標(biāo)準(zhǔn)上，幾項(xiàng)行動(dòng)已實(shí)施。例如疾病預(yù)防控制中心（CDC）近期批準(zhǔn)了一種用于抗環(huán)瓜氨酸肽抗體檢測(cè)的參考物質(zhì)[10]。乙酰膽堿受體抗體同樣需要參考物質(zhì)，為了能夠以國(guó)際單位IU對(duì)乙酰膽堿受體抗體的檢測(cè)數(shù)據(jù)實(shí)現(xiàn)定量表示，并協(xié)調(diào)和標(biāo)準(zhǔn)化這種自身抗體的測(cè)定。
｜原文來(lái)自｜
作者：Abbracciavento L , Fumarulo R , Tampoia M .
題目：Anti-AChR antibodies detected by ELISA method using an automated system (SkyLAB 752): evaluation of the analytical performance according to the Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) EP15-A[J].
期刊：Italian Journal of Laboratory Medicine
發(fā)表時(shí)間：2018.1.3
作者單位：Autoimmunology Section, Universitary Clinical Pathology Unit, Polyclinic of Bari, Department of Biomedical Sciences and Human Oncology, University of Bari Medical School, Bari, Italy
譯：RSRTJ
在線咨詢