谷氨酸脫羧酶(GAD)抗體是引起中樞神經(jīng)系統(tǒng)某些自身免疫疾病的致病性抗體之一。對(duì)于該類抗體在不同人群和疾病組中的分布，多國學(xué)者均做過調(diào)查研究。目前其準(zhǔn)確的發(fā)病機(jī)制仍待進(jìn)一步闡明。
今天筆者為大家?guī)淼淖g文原文節(jié)選自西班牙巴塞羅那的奧古斯特·皮伊·蘇涅爾生物醫(yī)學(xué)研究所(IDIBAPS)發(fā)表的論文，希望能給廣大讀者帶來啟發(fā)。
文章信息
題目:
GAD抗體相關(guān)神經(jīng)系統(tǒng)綜合征抑制性突觸蛋白抗體的種類和分布
Antibodies to Inhibitory Synaptic Proteins in Neurological Syndromes Associated with Glutamic Acid Decarboxylase Autoimmunity
期刊：PLOS ONE
發(fā)表時(shí)間：2015年3月
作者：Nuria Gresa-Arribas, Helena Ariño, Eugenia Martínez-Hernández, Mar Petit-Pedrol, Lidia Sabater, Albert Saiz, Josep Dalmau, Francesc Graus
摘要
谷氨酸脫羧酶抗體與多種神經(jīng)系統(tǒng)綜合征相關(guān)。目前仍不能明確綜合征的多樣性與不同的免疫顯性表位相關(guān)，還是與其他抑制性神經(jīng)突觸蛋白的特異性抗體相關(guān)。我們對(duì)106位GAD抗體相關(guān)綜合征患者(39例小腦共濟(jì)失調(diào)、32例僵人綜合征、18例癲癇、17例邊緣葉腦炎)檢查了血清與腦脊液。GAD65抗體滴度使用ELISA定量檢測(cè)。免疫印跡法用于檢測(cè)GAD65與GAD67抗原表位是否為線性結(jié)構(gòu)。在細(xì)胞學(xué)檢測(cè)中使用HEK293表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)N端GAD65、中心催化功能域、以及C端GAD65，用于檢測(cè)免疫顯性域。GAD67、GABAA受體、甘氨酸受體、GABAa受體相關(guān)蛋白以及橋蛋白這些物質(zhì)的特意抗體使用CBA檢測(cè)。GAD抗體內(nèi)化使用培養(yǎng)的大鼠海馬神經(jīng)元檢測(cè)。腦脊液GAD抗體滴度在小腦共濟(jì)失調(diào)患者與邊緣葉腦炎患者中要高于僵人綜合征患者(p=0.02）。在81%血清樣本與100%腦脊液樣本中檢出GAD67抗體。可被GAD65抗體識(shí)別的線性抗原出現(xiàn)于98%的患者中，相比之下GAD67抗體可識(shí)別的抗原僅占42%。GAD65催化結(jié)構(gòu)域在93%的患者血清中被識(shí)別，22%的血清和74%的腦脊液能同時(shí)識(shí)別N端，C端以及磷酸吡哆醛(PLP, GAD輔酶)這三個(gè)結(jié)構(gòu)域。六例GABAa受體抗體陽性患者和另外六例甘氨酸受體抗體陽性患者未出現(xiàn)相關(guān)癥狀。無患者檢出GABAa受體相關(guān)蛋白抗體和橋蛋白抗體。GAD65抗體在活的神經(jīng)元細(xì)胞中未發(fā)現(xiàn)內(nèi)化現(xiàn)象?？傊?，這些研究指出，無論神經(jīng)系統(tǒng)綜合征如何，腦脊液對(duì)GAD的免疫應(yīng)答要普遍于血清，也未發(fā)現(xiàn)臨床表現(xiàn)與抑制性突觸蛋白相關(guān)抗體間的特異性關(guān)聯(lián)。
簡(jiǎn)介
高滴度的谷氨酸脫羧酶抗體可見于多種神經(jīng)系統(tǒng)綜合征患者的血清中，包含僵人綜合征、小腦共濟(jì)失調(diào)、癲癇以及邊緣葉腦炎。這些病癥均表現(xiàn)為神經(jīng)系統(tǒng)GABA能系統(tǒng)異常。目前尚不清楚部分患者發(fā)展為特定綜合征的病因。與GAD抗體關(guān)聯(lián)的神經(jīng)系統(tǒng)綜合征初描述于1988年，但到目前為止，未再有更大更全面的研究來比較不同抗GAD相關(guān)綜合征患者的免疫反應(yīng)譜和異質(zhì)性。目前已有的研究規(guī)模較小或局限于僵人綜合征，重點(diǎn)在GAD65表型，或僅研究患者血清。此外根據(jù)推測(cè)，在GAD抗體陽性和LE或癲癇患者中，這些癥狀可能是由針對(duì)細(xì)胞表面抗原的更相關(guān)的自身抗體引起的，并且這些癥狀對(duì)免疫治療反應(yīng)良好。從另一個(gè)角度，某些邊緣葉腦炎患者和單獨(dú)的GAD抗體陽性患者可能癥狀更重。因此，確定不同的GAD抗體相關(guān)綜合征患者是否具有不同的潛在免疫應(yīng)答可能具有實(shí)際的臨床意義。
針對(duì)GAD65抗體的致病顯著性仍存爭(zhēng)議。部分研究指出這些抗體是直接的致病因素，但有些證據(jù)得出的結(jié)論與此相反。首先，相比于其他神經(jīng)系統(tǒng)表面抗原引起的自身免疫神經(jīng)系統(tǒng)疾病，GAD抗體陽性神經(jīng)系統(tǒng)綜合征的免疫治療效果較差；其次，疾病嚴(yán)重程度與抗體滴度間未發(fā)現(xiàn)相關(guān)性；第三，目前尚無這種神經(jīng)系統(tǒng)障礙的可信動(dòng)物模型。闡明致病機(jī)制目前仍需重要一步：GAD抗體可與活的神經(jīng)元結(jié)合，在內(nèi)化后可結(jié)合到胞內(nèi)GAD抗原。
為了驗(yàn)證這些問題，我們檢測(cè)了106例不同的GAD抗體相關(guān)神經(jīng)系統(tǒng)疾病患者的血清中如下幾種結(jié)構(gòu)的抗體：主要免疫優(yōu)勢(shì)區(qū)，線性抗原和構(gòu)象抗原，抑制性突觸受體或其他蛋白的共存抗體。除此之外觀測(cè)了GAD抗體是否會(huì)被活神經(jīng)元細(xì)胞內(nèi)化。
研究方法
患者選自1994年12月至2013年4月間，均由作者或相關(guān)醫(yī)師診治。這些患者的血清或腦脊液在西班牙巴塞羅那奧古斯特·皮伊·蘇涅爾生物醫(yī)學(xué)研究所(IDIBAPS）的神經(jīng)免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)室，或美國費(fèi)城的賓夕法尼亞大學(xué)中完成檢測(cè)。入組標(biāo)準(zhǔn)為：存在神經(jīng)系統(tǒng)障礙的患者經(jīng)腦部免疫組化檢測(cè)血清GAD65抗體，并由HEK239構(gòu)建的CBA加以確認(rèn)。其中，免疫組化步驟用于檢測(cè)在放射免疫法下GAD抗體滴度大于2000u/ml的患者。低于這個(gè)濃度的患者均患有1型糖尿病，多數(shù)從未有過神經(jīng)系統(tǒng)癥狀。明確或疑似副腫瘤綜合征的患者不包含在本研究中。
方法學(xué)構(gòu)建基于大鼠小腦的免疫組化
藉由親和素-生物素技術(shù)，GAD抗體的免疫反應(yīng)通過PFA固定的冷凍大鼠小腦觀察。待測(cè)血清稀釋500倍，腦脊液使用原濃度。在二抗的選擇中，使用四種鼠抗人IgG1-4作為不同的生物素標(biāo)記二抗，用以研究這種抗體的IgG亞型。
為了研究GAD抗體的鞘內(nèi)合成，使用免疫組化得到的GAD滴度結(jié)果，連同其對(duì)應(yīng)的腦脊液濃度將配對(duì)，同時(shí)使用腦脊液/血清白蛋白比值來計(jì)算GAD抗體的鞘內(nèi)合成指數(shù)。大于1的比值提示特異性IgG的鞘內(nèi)合成。
GAD65 ELISA
GAD抗體水平使用RSR的ELISA檢測(cè)。使用方式均參考產(chǎn)品說明書。由于神經(jīng)系統(tǒng)綜合征中GAD抗體濃度較高，血清和腦脊液中抗體的濃度在檢測(cè)前一般需要滴定來確認(rèn)稀釋度。一般來講，血清稀釋10000倍或腦脊液稀釋200倍后開始檢測(cè)流程。
免疫印跡法
人類GAD65、GAD67、GABARAP重組蛋白通過電泳進(jìn)行分離，隨后轉(zhuǎn)移至PVDF膜上同患者稀釋1000倍的血清孵育。先后結(jié)合GAD65、GAD67、GABARAP對(duì)應(yīng)的商品抗體和生物素標(biāo)記的羊抗人或馬抗鼠IgG后，使用DAB鹽酸鹽顯色。在部分試驗(yàn)中我們使用ECL印跡系統(tǒng)。商品化GAD65和GAD67抗體的特異性通過CBA予以確認(rèn)。
基于HEK293細(xì)胞的免疫細(xì)胞化學(xué)染色
為了檢測(cè)不同突觸抗原的對(duì)應(yīng)抗體，HEK293細(xì)胞中轉(zhuǎn)染了人類GAD65和GAD67，以及GABAaR和GABARAP的α1和β3亞單位、甘氨酸受體α1亞單位、橋蛋白。轉(zhuǎn)染24小時(shí)后HEK293按流程開始活細(xì)胞或固定后檢測(cè)。HEK293和40倍稀釋的患者血清或5倍稀釋的腦脊液孵育，同時(shí)結(jié)合相應(yīng)的商品化抗體，然后與羊抗人IgG Alexa Fluor 488或羊抗鼠IgG孵育。當(dāng)使用活的HEK293時(shí)，使用4%PFA和0.3% triton X-100進(jìn)行固定操作。完成同患者血清和商品化抗體結(jié)合的操作后，使用熒光顯微鏡照相。
為了驗(yàn)證構(gòu)建的CBA，使用50例不同神經(jīng)系統(tǒng)障礙患者(20神經(jīng)系統(tǒng)退行性變、15例NMDAR抗體陽性、10例Hu抗體陽性、5例其他神經(jīng)免疫疾病)的血清和17例1型糖尿病患者血清進(jìn)行性能驗(yàn)證。全部血清在本CBA中均檢測(cè)為陰性。T1DM組患者中，10例患者抗體滴度較高。這提示本方法相比于放射免疫法，在T1DM典型的抗體滴度區(qū)間內(nèi)對(duì)低滴度GAD65抗體缺乏足夠的靈敏度。
GAD65表型分析
我們?cè)O(shè)計(jì)了表達(dá)N端(aa 1-188）、中心區(qū)含磷酸吡哆醛(aa189-464)、C端(aa465-585）GAD65的質(zhì)粒。轉(zhuǎn)染至HEK293后進(jìn)行相應(yīng)的免疫組化實(shí)驗(yàn)。每種成分的成功表達(dá)使用Myc標(biāo)簽蛋白的對(duì)應(yīng)商品抗體加以確認(rèn)。
神經(jīng)元表面抗原抗體的分析
使用大鼠腦組織實(shí)施免疫組化和大鼠海馬、腦神經(jīng)元培養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行免疫熒光的方式加以研究。
GAD抗體內(nèi)化研究
為研究GAD抗體的內(nèi)化過程，GAD抗體陽性腦脊液稀釋25倍后，在37℃下和大鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞孵育24小時(shí)。清洗后和未標(biāo)記的抗人IgG抗體37度孵育1小時(shí)。清洗后使用4%PFA和0.1%triton X-100固定，再加入Alexa Fluor 488標(biāo)記的抗人IgG。我們選擇了NMDAR抗體陽性的腦脊液作為陽性對(duì)照。
統(tǒng)計(jì)分析
使用非參數(shù)檢驗(yàn)、卡方、ANOVA作為檢驗(yàn)方法。由于ELISA值不遵從正態(tài)分布，在統(tǒng)計(jì)分析前使用對(duì)數(shù)變換將其標(biāo)準(zhǔn)化。P<0.05視為有顯著意義。
結(jié)果
抗體檢測(cè)結(jié)果
在CBA中，100%患者均檢出GAD65抗體、88%患者檢出GAD67抗體。GAD67抗體在小腦共濟(jì)失調(diào)、僵人綜合征、邊緣葉腦炎以及癲癇組中無頻數(shù)的顯著差異。相反，全部腦脊液(61例）均同時(shí)檢出GAD65和GAD67抗體。在配對(duì)樣品中有9對(duì)樣品呈現(xiàn)血清陰性但腦脊液GAD67陽性。這9例樣品均勻分布與各患者組中。免疫組化分析IgG亞型顯示全部106例患者中占主導(dǎo)地位的亞型為IgG1。
在小腦共濟(jì)失調(diào)組和邊緣葉腦炎組中，血清GAD65抗體水平較高。在腦脊液中這個(gè)結(jié)論也成立，即共濟(jì)失調(diào)組和邊緣葉腦炎組的腦脊液濃度高于僵人綜合征組。此外，小腦共濟(jì)失調(diào)組的鞘內(nèi)合成指數(shù)的中位數(shù)(9.7)也要高于僵人綜合征組(5.3),p=0.38. 無論患者血清中是否含有GAD67抗體，血清GAD67抗體含量與GAD65濃度均相關(guān)(p=0.02)
GAD抗體表型分析
為闡明GAD65與GAD67抗體是否能辨識(shí)線性抗原，全部106例樣品使用免疫印跡法進(jìn)行篩查。除兩例外其余98%樣品均和GAD65抗原反應(yīng)。39例（39/93)GAD67陽性患者為免疫印跡陽性。可與GAD67反應(yīng)的血清，與特定的神經(jīng)系統(tǒng)綜合征間無相關(guān)性。
研究GAD65抗體與不同癥狀組GAD65抗原活性區(qū)(N/C/PLP）間的關(guān)系。由于亞克隆并未對(duì)GAD65免疫活性構(gòu)成影響，我們使用全部106例血清和腦脊液使用轉(zhuǎn)染這三個(gè)部分的HEK239進(jìn)行檢測(cè)。46%患者血清GAD65抗體僅識(shí)別一個(gè)區(qū)域，相比之下74%GAD65陽性腦脊液可識(shí)別全部三個(gè)區(qū)域。被識(shí)別頻數(shù)占據(jù)主流的部分為磷酸吡哆醛(PLP），有93%患者樣品可識(shí)別此結(jié)構(gòu)域，這其中也包含部分GAD65抗體濃度較低的患者。GAD65抗體水平和對(duì)特定表型的反應(yīng)間無相關(guān)性。邊緣葉腦炎患者組的GAD65抗體更傾向于結(jié)合N端域，癲癇組患者體內(nèi)抗體傾向于結(jié)合C端域。我們?cè)谀X脊液結(jié)果中未發(fā)現(xiàn)此差異?？贵w識(shí)別的結(jié)構(gòu)域數(shù)量頻數(shù)在有或無GAD67的兩組抗體組中較相似。因此GAD67抗體的存在與GAD65反應(yīng)程度無相關(guān)性。
GABA能抑制性突觸的其他抗體
106例血清和61例腦脊液接受了大鼠海馬神經(jīng)元免疫熒光測(cè)試。其中6名患者檢出GABAaR抗體，6名患者檢出甘氨酸受體抗體陽性。除此之外未檢出其他抗體。
GAD抗體的內(nèi)化過程
假定GAD抗體為致病抗體，抗體應(yīng)能接觸到胞內(nèi)抗原，因此該抗體可形成內(nèi)化。在這個(gè)試驗(yàn)中我們首先確認(rèn)我們培養(yǎng)的神經(jīng)元細(xì)胞內(nèi)包含有GAD65。首先我們固定了神經(jīng)元細(xì)胞，然后分別同商品化的GAD65抗體以及患者的腦脊液一同孵育。在這項(xiàng)預(yù)試驗(yàn)中我們確認(rèn)了細(xì)胞內(nèi)含有對(duì)應(yīng)抗原，同時(shí)商品抗體和患者腦脊液中均觀察到當(dāng)細(xì)胞膜通透時(shí)，發(fā)生了抗原抗體結(jié)合。我們又實(shí)驗(yàn)了患者體內(nèi)的抗體能否同活的神經(jīng)元細(xì)胞反應(yīng)，使用大鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞分別同4例小腦共濟(jì)失調(diào)、4例僵人綜合征、3例邊緣葉腦炎、5例癲癇患者的含抗體腦脊液孵育24小時(shí)。在這個(gè)實(shí)驗(yàn)中我們選擇了一例抗NMDAR腦炎患者的腦脊液作為對(duì)照。實(shí)驗(yàn)結(jié)果中我們未觀察到4個(gè)實(shí)驗(yàn)組以及對(duì)照組出現(xiàn)胞內(nèi)染色。因此我們得出結(jié)論，GAD65抗體僅僅在細(xì)胞膜高通透狀態(tài)下與GAD65抗原結(jié)合，在活體神經(jīng)元細(xì)胞中無法完成這一過程。
討論和結(jié)論
我們總結(jié)了以下特性：
1. 在血清和腦脊液中的體液免疫響應(yīng)存在差異。腦脊液中的抗體可以與多個(gè)結(jié)構(gòu)域結(jié)合，同時(shí)與GAD67可發(fā)生反應(yīng)。由于9/61例患者出現(xiàn)血清陰性腦脊液陽性的結(jié)果，加上腦脊液抗體可識(shí)別更別結(jié)構(gòu)域，這提示腦脊液中的GAD65抗體不僅僅是從血清到腦脊液的被動(dòng)轉(zhuǎn)移，還可能存在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的主動(dòng)響應(yīng)。
2. 邊緣葉腦炎和小腦共濟(jì)失調(diào)患者的腦脊液抗體滴度比僵人綜合征患者高。
3. 全部神經(jīng)系統(tǒng)綜合征患者中GABA能抑制性突觸抗原抗體出現(xiàn)的頻數(shù)非常少
4. GAD抗體因其未觀察到內(nèi)化效應(yīng)，因此可能不是直接的致病因素。
5. 我們未發(fā)現(xiàn)橋蛋白和GABARAP抗體。過往報(bào)道中指出僅1例僵人綜合征患者伴發(fā)縱隔腫瘤時(shí)檢出這兩種抗體，但報(bào)道發(fā)表于2006年且從未被重現(xiàn)過。同時(shí)檢測(cè)方法學(xué)也存在差異：GABARAP抗體初使用免疫共沉淀和免疫印跡法檢測(cè)，我們?cè)诒狙芯恐惺褂肅BA。我們無法證實(shí)是否因CBA的靈敏度過低導(dǎo)致這種結(jié)果，如果并非如此，GABARAP抗體的水平應(yīng)非常低。
6. GAD65抗體表型的研究中提示，1型糖尿病中的GAD65抗體大部分識(shí)別磷酸吡哆醛部分和C端結(jié)構(gòu)域。先前的僵人綜合征隊(duì)列研究中指出，GAD65抗體識(shí)別C端兩個(gè)不連續(xù)的結(jié)構(gòu)域，大部分血清抗體可識(shí)別N端至少一個(gè)結(jié)構(gòu)域。其他研究者也發(fā)現(xiàn)了一個(gè)位于N端的線性表型抗原。在我們的研究中磷酸吡哆醛部分是血清抗體識(shí)別頻數(shù)多的，在全部僵人綜合征患者中均可被識(shí)別，可認(rèn)為是提供主要免疫原性的部位。在全部4個(gè)患者組中我們未發(fā)現(xiàn)主要免疫原部位的顯著差異。由于本研究中將GAD65分解為3個(gè)大片段，可能會(huì)遺漏一些較小的蛋白質(zhì)片段，這些片段抗原有可能會(huì)引起特定的神經(jīng)系統(tǒng)綜合征。
7. GAD抗體的病理學(xué)作用一直受到爭(zhēng)論。體外研究指出僵人綜合征患者的GAD抗體抑制了GAD65的酶活性，而1型糖尿病患者的抗體不存在這個(gè)現(xiàn)象。來自GAD抗體陽性的僵人綜合征患者和小腦共濟(jì)失調(diào)患者純化的抗體或直接使用人單抗，經(jīng)鞘內(nèi)或小腦內(nèi)注射后可誘發(fā)類似這些患者的癥狀或神經(jīng)生理學(xué)改變。然而這些實(shí)驗(yàn)未能明確闡述這些變化與GAD65抗體直接相關(guān)。于此相似的是對(duì)動(dòng)物的主動(dòng)免疫實(shí)驗(yàn)并未引起神經(jīng)系統(tǒng)障礙。想證明GAD65的直接致病性需要先證實(shí)GAD65抗體在活體內(nèi)存在內(nèi)化反應(yīng)。先前研究中指出GAD65人單抗可被大鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)胞系內(nèi)化，或被大鼠腦皮層注射部位附近的神經(jīng)元內(nèi)化。然而這些研究無一例證實(shí)體內(nèi)也存在相同反應(yīng)。為了進(jìn)一步探究GAD65的致病性，我們需在將來的研究中明確的闡述動(dòng)物模型中GAD抗體如何到達(dá)抗原處，通過高分共聚焦顯微鏡觀察抗原抗體的結(jié)合，觀察與綜合征相關(guān)聯(lián)的GAD的潛在影響。
因此，本研究重申了研究中樞神經(jīng)系統(tǒng)綜合征患者腦脊液中GAD自身免疫的重要性，因其抗體在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中可識(shí)別抗原上多種免疫原結(jié)構(gòu)域。我們未發(fā)現(xiàn)GAD抗體相關(guān)綜合征中特定的免疫優(yōu)勢(shì)區(qū)或相關(guān)抗體可作為標(biāo)志物。更多的是，GAD抗體因其在活細(xì)胞中無法內(nèi)化，其直接致病性仍存疑。
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